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常见问题与解答

  • 多肽纯度选择建议

         一般来说,相同序列和修饰、相同数量的多肽会因为其纯度的不同而价格各异,纯度越高,单位质量的多肽价格也越高。肽谷生物可以提供粗品、脱盐,70%到99%不同纯度级别的多肽供客户按需选择使用。 各种多肽纯度及应用范围如下:

    应用领域

    对应纯度选择

    大规模功能性筛选

    粗品多肽

    肽微阵列


    作为制备抗体的抗原


    层析法


    酶联免疫吸附试验检测抗血清滴度

    >70%和>75%的多肽

    免疫印迹法(非定量)


    酶底物肽(非定量)


    封闭肽(非定量


    亲和纯化

    磷酸化检测

    蛋白电泳的应用和免疫细胞化学

    >80%,>85%和>90%的多肽

    标准酶联免疫吸附试验和RIA(定量)


    受体配体相互作用(定量)


    体内、体外 生物学测定


    酶的研究和阻断实验(定量)

    NMR研究

    质谱分析

    其他定量检测

    >95%的多肽

    SAR研究


    临床试验


    APIs(药物活性成分)


    工业品

    X-ray晶体研究

    其他敏感的实验:酶与底物、受体与配体相互作

    用、阻断和竞争实验

    >98%的多肽

  • 多肽保存方法建议

    所有的冻干多肽产品可以在常温下避光运输,并可以在室温条件下保存几天或者少于一个星期,多肽性状是稳定的。所有的冻干多肽产品,都必须保存在干燥低温的条件下,以-20℃的低温为佳,若有条件最好保存在-80℃以下,在这样的条件下大多数多肽可存放1-2年。

    当需要使用多肽产品时,应在开盖之前将多肽产品升至室温;对保存于-20℃的产品,该过程需要1h或更长,因包装大小而异。否则,当打开瓶盖时,水气进入会导致多肽凝缩而降低其稳定性。一旦打开,应迅速称量完毕,并立即密闭以免潮解,亲水肽尤其应注意。

    对序列中含有Cys、Met、Try的易氧化多肽和含有Gln、Asn、Asp的易降解多肽,应避免反复融冻,以免多肽被氧化和降解,因此建议分装成小包装保存。需要多少解冻多少,用后弃去,不要保存。

    对于暂时不用的多肽,不要以溶液的形式保存(即使在-80°C的条件下)。

  • 多肽溶解方法建议

          多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性。酸性的蛋白溶解于碱性溶液, 而碱性蛋白可溶解于酸性溶液,含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中,如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇,然后加蒸馏水稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解,因为DMSO可能造成侧链氧化。

          多肽溶解测试: 在多肽溶解之前先取小部分进行多肽溶解测试,您需要测试几种不同的溶剂,直到找到最适当的一种。超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。(注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。)

    碱性氨基酸: K, R, H, N-terminus
    酸性氨基酸: D, E, C-terminus
    极性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y
    非极性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙酰基,酰胺基

          1,

    将每个酸性氨基酸赋值为-1,包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、以及羧基末端-COOH。 每个碱性氨基酸赋值为+1,包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)以及氨基末端-NH2。然后计算整个多肽的电荷数。

         2,

    如果整段肽所带电荷是阳性的,说明该肽是碱性的。可先尝试用蒸馏水来溶解;如果不溶于水,接着尝试用少量10%-25%醋酸溶解,如果仍然失败的话,添加一些TFA(10-50微升)来增溶,然后用水稀释至理想浓度。

          3,

    如果整段肽所带电荷是阴性的,说明该肽是酸性的。酸性的多肽可以尝试用PBS(PH 7.4)来溶解, 如果不溶的话,添加少量的碱性溶剂,如0.1 M的碳酸氢铵,然后加水稀释至理想浓度。含有游离半胱氨酸的多肽应溶于脱气的酸性缓冲液中,因为当PH值大于7时,巯基会被迅速氧化成二硫化物。

          4,

    如果整段肽电荷是零,说明肽是中性的。中性肽通常溶于有机溶剂。首先,尝试添加少量乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水的多肽,可使用少量的二甲基亚砜溶解,然后用水稀释至理想浓度。对于含有自由半胱氨酸的肽,需使用DMF而不是DMSO。对于有聚集倾向的肽,可添加6M盐酸胍或8M尿素,然后进行必要的稀释。

          为了防止或尽量减少多肽降解,请将多肽以冻干粉形式保存在-20°C,-80°C更佳。如果需要保存溶液肽,最好分成小样存放,以避免反复冻融。一份样品融冻后未用完,应扔掉。细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦,所以请将肽溶于无菌水或肽溶液过滤除菌。

  • 多肽荧光标记选择建议

              如何选择合适的荧光标记基团取决于您的实验需求。药理学实验研究基本分为体内研究和体外研究两大类。

    对于体内研究,一般选择发射波长在650-900nm的荧光基团,例如:ICG、Cy5.5和 Nile Blue。这是因为这类基团所发出的荧光具有较好的组织穿透能力,受背景干扰较小(水、血红蛋白和脱氧血红蛋白一般都会产生背景干扰吸收,其区域在560nm左右)。

    对于体外研究,发射波长在400到600nm的荧光基团最为常用,例如:AMC、FITC和TAMRA。

             荧光标记的多肽在现代医学中的应用是很广泛的。例如:用Cy5.5标记的目标多肽研究对 c-Met受体的绑定作用。有人设计含有KSLSRHDHIHHH序列的cMBP,其C端为GGGSC, C端Cys用 Cy5.5-Maleimide标记其巯基侧链。研究结果表明:上述Cy5.5-cMBP多肽与U87MG肿瘤细胞共孵24小时后,具有较高的癌细胞摄取值,其响应浓度在纳摩尔级别。

  • 多肽不稳定的原因

    脱酰胺反应:在脱酰反应中,Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。 在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

    氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中,Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。

    水解:多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。

    形成错误的二硫键:二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。

    消旋:除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。

    β-消除:β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。

    变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。

  • 提高多肽稳定性建议

    1)

    定点突变: 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基, 可提高多肽的稳定性。

    2)

    化学修饰: 多肽的化学修饰方法很多,研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合 物,在体内可降解,无毒。PEG与多肽结合后能改善多肽的溶解性,可以进行生物相容性调节,提高热稳定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延长体内半衰期。 选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。

    3)

    添加剂: 通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围,因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中,上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象 ,而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。

    4)

    冻干: 多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与,水还可以作为其它反应剂的流动相。另外,水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此,冻干可提高多肽的稳定性。

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