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FRET荧光标记技术

      荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复基态时,发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染,操作简便等优点,使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激酶、磷酸酶、肽酶等)。肽谷生物经过长期开发,能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

  • 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

          荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射能量跃迁,通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。此过程没有光子的参与,所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。
          用于FRET试验的染料是可以相同的。但在大多数应用中其实是使用不同的染料。例如,一个供体基团(EDANS)和接受基因(DABCYL)匀被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上,当该底物未被切断时,DABCYL可淬灭EDANS,从而检测不到荧光。当该底物被HIV-1蛋白酶切断后,EDANS不再被DABCYL淬灭,随即可检测到EDANS荧光。蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。
          FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具,由于其反应过程可被连续监测,为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的,表现出的是内部的荧光猝灭,但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光,此荧光可被连续检测,从而可对酶的活性进行定量分析。FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物,比如:肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征;对新的蛋白水解酶的筛选和检测;对多肽折叠的构象研究等。

  • ·常用FRET的标准染料组合

    Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
    Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
    Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA)
    and 2,4-Dinitrophenyl(DNP):
    MCA/Lys(Dnp).
    Ortho-aminobenzoic acid (Abz)
    and 2,4-dinitrophenyl (Dnp)
    Abz/Tyr (NO2) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp):
    Abz/Tyr (NO2)
    Abz/EDDnp
    Dabcyl and Glu(EDANS): Dabcyl/Glu(EDANS)
  • ·FRET共振能量转移引发荧光猝灭的激发与发射波

  • 猝灭剂

    荧光团

    激发波(nm)

    发射波(nm)

    Dabcyl

    Edans

    336

    490

    Dansyl

    Trp

    336

    350

    DNP

    Trp

    328

    350

    DNP

    MCA

    328

    393

    DNP

    Abz

    328

    420

    Tyr (NO2)

    Abz

    320

    420

  • · 常规RET供体(Donor)-接受(Aceptor)对的福斯特临界距离(Forster Critical Distance)

    供体

    受体

    福斯特临界距离(nm)

    Tryptophan

    Dansyl

    2.1

    IAEDANS (1)

    DDPM (2)

    2.5-2.9

    BFP

    DsRFP

    3.1-3.3

    Dansyl

    FITC

    3.3-4.1

    Dansyl

    Octadecylrhodamine

    4.3

    CFP

    GFP

    4.7-4.9

    CF (3)

    Texas Red

    5.1

    Fluorescein

    Tetramethylrhodamine

    4.9-5.5

    Cy3

    Cy5

    5.0

    GFP

    YFP

    5.5-5.7

    BODIPY FL (4)

    BODIPY FL (4)

    5.7

    Rhodamine 6G

    Malachite Green

    6.1

    FITC

    Eosin Thiosemicarbazide

    6.1-6.4

    B-Phycoerythrin

    Cy5

    7.2

    Cy5

    Cy5.5

    >8.0

          (1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
          (2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
          (3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
          (4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene

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