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FITC&AMC等荧光标记技术

      荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复基态时,发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染,操作简便等优点,使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激酶、磷酸酶、肽酶等)。肽谷生物经过长期开发,能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

  • FITC&AMC等荧光标记技术简介

          除了FRET荧光淬灭组合,肽谷生物还可以提供包括FITC, FAM, TAMRA, Biotin等种类齐全的多肽荧光标记服务。
    下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构:

          下表是一些荧光物质的激发光波长Ex(nm)和发射光波长Em(nm):

  • 荧光基团

    Ex(nm)

    Em(nm)

    荧光基团

    Ex(nm)

    Em(nm)

    羟基香豆素

    325

    386

    R-phycoerythrin
    (PE) (489)

    565

    578

    丹磺酰氯

    340

    578

    Rhodamine Red-X

    560

    580

    AMC

    345

    445

    Tamara

    565

    578

    甲氧基香豆素

    360

    410

    Alexa fluor 555

    556

    573

    Alexa fluor 系列

    345

    442

    Alexa fluor 546

    556

    573

    氨基香豆素

    350

    445

    Rox

    575

    602

    Dabcyl

    453

    -

    Alexa fluor 568

    578

    603

    Cy2

    490

    510

    Texas Red

    589

    615

    FAM

    495

    517

    Alexa fluor 594

    590

    617

    Alexa fluor 488

    494

    517

    Alexa fluor

    621

    639

    FITC

    495

    519

    Alexa fluor 633

    650

    668

    Alexa fluor 430

    430

    545

    Cy5 (625)

    650

    670

    5-FAM

    492

    518

    Alexa fluor 660

    663

    690

    Alexa fluor 532

    530

    555

    Cy5.5

    675

    694

    HEX

    535

    556

    TruRed 490

    675

    695

    5-TAMRA

    542

    568

    Alexa fluor 680

    679

    702

    Cy3

    550

    570

    Cy7

    743

    767

    TRITC

    547

    572

    Cy3.5

    581

    596

  • · FITC修饰


          FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性,我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽上:(1) 将FITC标记于赖氨酸(Lys)或被选择性地脱保护的鸟氨酸(ornithine)侧链氨基上;(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。
          当在N端标记时,建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入烷基间隔器(alkyl spacer)如氨基己酸(Ahx)。链接切割需要酸性环境,在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有最后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时,这种情况可避免。空间位阻被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因,而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。
          Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

  • · AMC修饰


          AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)是一种应用广泛的荧光标记试剂, 与其他荧光染料不同的是,AMC修饰多肽分子是从C端进行:
          (1)AMC与肽链C端第一个氨基酸反应;
          (2)固相合成整条肽链(从第二个氨基酸开始),并且保留整条肽链的侧链保护基和最后一个氨基保护基;
          (3)液相缩合AA-AMC与全保护的肽链;
          (4)切除保护基,完成肽链的修饰。

          通常,生物素、FITC等染料可任意标记在多肽N端或C端。但我们推荐N端标记,其成功率更高、所需时间更短、更易操作。由于多肽都是从C端往N端合成,所以N端修饰将是固相合成的最后一步,不再需要额外的偶联步骤。相反,如果是C端标记,则需要附加步骤,而过程会更复杂。
          大多数染料都是大型的芳香分子,如此庞大分子的介入有助于避免标签和多肽之间的相互作用。这将有助于保持多肽的构象和生物学活性。一般来说,推荐引入一个柔性间隔如Ahx(一个6碳化合物)会使荧光标记更加稳定。否则FITC将很容易与其他任何位置的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的氨基发生连接。

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