欢迎来到肽谷生物-专业多肽定制。

服务热线:+86-(0)-18115476705

多肽磷酸化标记技术

      磷酸化影响着细胞生命的方方面面。在细胞中,大概有1/3的的蛋白质被认为是通过磷酸化修饰的。蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关,如DNA损伤修复、转录调节、信号传导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可以帮助人们阐述上述过程的机理,进一步认识生命活动的本质。肽谷生物依据自身原料优势和技术优势,可以合成含有磷酸化丝氨酸(pSer)、磷酸化苏氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的多肽,并可以提供含有一个,两个,三个,四个,五个磷酸化位点修饰的高质量多肽。

  • 多肽磷酸化标记简介

          磷酸化多肽主要指肽链中的Ser、Tyr和Thr残基的侧链羟基被修饰成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具,因此研究蛋白质及多肽的磷酸化反应并确定成熟简便的合成路线就变得非常重要。目前,多肽的磷酸化修饰方法主要有两种:
          (1)将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中;
          (2)多肽序列在树脂上合成完后,再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
         

    1)将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中:


    即事先将需要磷酸化的氨基酸(Thr,Ser或Tyr)磷酸化并适当保护,然后按照正常SPPS合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便,已经成为多肽单位点磷酸化修饰的主要方法。

         

    2)多肽序列在树脂上合成完后,再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化:


    采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时,磷酸化的氨基酸由于侧链修饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合,并且之后的氨基酸引入都会比较困难,尤其在含有多个磷酸化位点修饰时,合成将变得异常困难,并且最终产物成分复杂,难以分离,产率极低。因此,当肽链中多个位点进行磷酸化时,可以考虑采用将多肽序列在树脂上合成完后,再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化:其合成过程主要就是在多肽合成结束之后,选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基,对于Tyr,Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱除。采用这种方法时,可以采用双苄基亚磷酰胺,四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体,连接到羟基上,然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基,完成反应。

  • 检测蛋白质磷酸化的方法简介

    激酶活性检测


    在体外,激酶活性的检测是将经免疫沉淀法获得的蛋白激酶与某一底物在ATP环境下共同孵育,然后再检测。磷酸化底物的测量可以通过报告系统如比色法、放射性或荧光检测而得。

    磷酸化特定性抗体的开发


    磷酸化抗体已被许多研究者使用。首先合成磷酸化多肽,即围绕靶蛋白磷酸化位点的氨基酸序列,接着共轭偶联至血蓝蛋白(KLH)上进行免疫。免疫血清将流经多肽亲和层析柱, 从而得到一个非常特异的免疫制剂。检测的成功与否取决于抗体对靶磷酸化蛋白的特异性和亲和力。

    免疫印迹(Western Blot)


    许多磷酸化抗体是十分敏感的,可以很容易地检测到常规样品中的磷酸化蛋白。化学发光和比色法都是较常见的检测方法,蛋白Markers通常用来为蛋白质量提供标准。

    酶联免疫吸附试验(ELISA)


    ELISAs提供一种间接测量激酶活性的方法,其比WB更容易定量。磷酸化特异的ELISA技术可以很轻易地通过使用一个校准标准来量化结果。通过双抗体夹心方法,应用两个靶蛋白的特异性抗体可使检测呈现高特异性。此外,基于微孔板的ELISAs检测,更是具有高通量、 微量和对低丰度蛋白检测的特点。

    细胞ELISA(Cell-Based ELISA)


    通过分析完整的细胞中磷酸化蛋白,可更准确地反应特性的信号网络状态。一般磷酸化抗体多通过荧光或比色法来检测磷酸化状态。

    流式细胞术(FCM)和ICC/IHC


    流式细胞术因其快速、定量、单细胞分析等特点而非常具有优势。细胞被诱导后,通过甲醛或多聚甲醛将其与磷酸化蛋白交联固定,然后分析。固定的细胞需经通透处理,以便磷酸化抗体的进入。

    质谱分析(Mass Spectrometry)


    质谱(MS)技术是一项用于识别磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化残基序列的便利工具。利 用MS卓越的灵敏度和分辨率,可识别某一单个蛋白质或多肽。但来自磷酸化多肽的信号通常较弱,因而新的技术正在被研发以增强MS信号。这些策略包括固化金属亲和层析,磷酸化抗体的丰富,化学修饰方法和用生物素部份置换磷酸基团。

    xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技术


    Multi-Analyte profiling技术涉及磷酸化抗体的应用和基于微孔板及膜的检测方式。这些检测技术可提供大量的数据,却只需极少量的样本。然而,这些检测技术并不比传统的检测方法敏感,原因在于潜在的抗体交叉反应。

Copyright ©2020 南京肽谷生物科技有限公司 备案号:苏ICP备19062824号-1 网站地图